在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，去除原培養(yǎng)基并將細(xì)胞從原培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中，維持細(xì)胞的活力與增殖。細(xì)胞傳代既可以擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)量，也能夠避免細(xì)胞因進(jìn)入平臺(tái)期而出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制甚至死亡的情況。那么你知道細(xì)胞傳代的實(shí)驗(yàn)步驟是什么嗎？有何注意事項(xiàng)呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 貼壁細(xì)胞的傳代:

1) 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及密度，評(píng)估細(xì)胞的狀態(tài)，以作為傳代比例的參考。

2) 提前紫外殺菌（至少30min為宜）操作臺(tái)及實(shí)驗(yàn)材料。

3) 注意無(wú)菌操作，在操作臺(tái)中吸除或倒掉培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)液（盡可能去除干凈，鈣離子、鎂離子和血清蛋白的存在會(huì)降低胰酶活力）。

4) 加入適量PBS緩沖液洗滌1~2次。

5) 加入1~2 mL胰酶（以全部覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)），輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使胰酶充分接觸細(xì)胞（建議：胰酶分裝成適量，提前水浴復(fù)溫到37℃）。

6) 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞變圓且大多數(shù)細(xì)胞脫落時(shí)，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度（加入胰酶后，邊計(jì)時(shí)邊顯微鏡下觀察，記錄細(xì)胞消化的時(shí)間，供今后細(xì)胞消化參考）

7) 加入2~3 mL 含血清完quan培養(yǎng)液（也可以考慮使用該細(xì)胞本次的培養(yǎng)上清），終止消化，輕柔吹打，使細(xì)胞完quan脫落。

8) 收集細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至離心管中，1500 rpm 離心5 min（必要時(shí)可以考慮，低速、短時(shí)間的離心有助于去除細(xì)胞碎片、細(xì)菌污染等）。

9) 棄去上清液，加入適量體積含血清培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度、是否有密度依賴(lài)性及計(jì)劃傳代的時(shí)間等特點(diǎn)，按照比例將細(xì)胞懸液分裝入2個(gè)或多個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)可預(yù)先加入適量培養(yǎng)基。注意細(xì)胞充分混勻，保證細(xì)胞均勻分布。 

2. 懸浮細(xì)胞的傳代：可通過(guò)離心收集后用含血清的培養(yǎng)基直接傳代。

二、注意事項(xiàng)

1. 嚴(yán)格無(wú)菌操作！

2. 適度消化：提前復(fù)溫胰酶37℃以及消化計(jì)時(shí)，易保證消化過(guò)程穩(wěn)定。消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易影響細(xì)胞狀態(tài)及活性，消化時(shí)間過(guò)短易多細(xì)胞成團(tuán)，影響實(shí)驗(yàn)效果。

3.吹打過(guò)程要輕柔，避免細(xì)胞液的灑濺。

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