感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高達(dá) 108 cfu/µg，具鏈霉素抗性，其轉(zhuǎn)化后單菌落的生長(zhǎng)數(shù)多，生長(zhǎng)速度比 DH5α 略快，相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)的菌斑略大于DH5α。適用于高效的 DNA 克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增。能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定復(fù)制。

操作步驟：

使用前請(qǐng)先在漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽。

1. 柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000 rpm（~13,400×g）離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（使用當(dāng)天處理過(guò)的柱子）

2. 取1-5 ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，12,000rpm （~13,400×g）離心1 min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。

3. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250μI溶液P1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹di懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。

注意：如果有未徹di混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

4. 向離心管中加入250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。

注意：溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗帲悦獯驍嗷蚪MDNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片斷。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過(guò)多，裂解不徹di，應(yīng)減少菌體量。

5. 向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm（~13,400×g）離心10min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到過(guò)濾柱CS（過(guò)濾柱放入收集管中），注意盡量不要吸出沉淀。

注意：P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

6. 12,000 rpm（~13,400×g）離心2 min，小心地將離心后收集管中得到的溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），（如果過(guò)濾柱中有殘余的液體說(shuō)明步驟5吸取的上清中雜質(zhì)過(guò)多，可以延長(zhǎng)離心的時(shí)間；如果離心后收集管底部有少量的沉淀，盡量的吸取上清）。

7. 12.000 rpm （~13,400×g）離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

8.向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm （~13.400×g）離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

 9. 向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

10.重復(fù)操作步驟9。

11.將吸附柱CP3放入收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP3開(kāi)蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹di晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

12.將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100μI洗脫緩沖液TB，室溫放2min,12,000rpm（~13,400×g）離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

注意：為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，重復(fù)步驟12。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用ddH20做洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μl，體積過(guò)小影響回收效率。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20°C，以防DNA降解。

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