產品名稱：碧云天beyotime線粒體膜電位與細胞凋亡檢測試劑盒(C1071M)現貨供應

產品貨號：C1071M

產品品牌：碧云天beyotime

使用方法：

1. 對于懸浮細胞：

a. 在進行完細胞凋亡刺激后，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續Annexin V-FITC的結合。

b. 取5-10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入188μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。

c. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。

d. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。

e. 如果用于流式細胞儀檢測，可立即上機檢測，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC為綠色熒光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342為藍色熒光(Ex/Em:350/461nm)，很多時候流式檢測僅檢測紅色和綠色熒光即可，也可以同時檢測紅綠藍三色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。

注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測；熒光探針的濃度可以根據具體的染色效果進行適當調整，以獲得更好的染色效果；熒光顯微鏡檢測或流式細胞儀檢測時，都可以不加入Hoechst 33342染色液。

2. 對于貼壁細胞的消化后檢測：

a. 把細胞培養液吸出至一合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液(可含有EDTA)消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

注意：對于貼壁細胞，胰酶消化步驟很關鍵。胰酶消化時間如果過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷；消化時間如果過長，同樣易造成細胞膜損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結合從而干擾對于細胞凋亡的檢測。同時，胰酶細胞消化液中應盡量不含EDTA，因為EDTA可能會影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結合。

b. 加入步驟2a中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。注意：加入步驟2a中的細胞培養液一方面可以收集已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續加入的Annexin V-FITC導致染色失敗。

c. 取5-10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入188μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。

d. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。

e. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。

f. 如果用于流式細胞儀檢測，可立即上機檢測，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC為綠色熒光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342為藍色熒光(Ex/Em:350/461nm)，很多時候流式檢測僅檢測紅色和綠色熒光即可，也可以同時檢測紅綠藍三色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。

注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測；熒光探針的濃度可以根據具體的染色效果進行適當調整，以獲得更好的染色效果；熒光顯微鏡檢測或流式細胞儀檢測時，都可以不加入Hoechst 33342染色液。

3. 對于貼壁細胞的原位熒光檢測：

注：本方法的優點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。

a. (選做)如果條件許可，把細胞培養于24孔板、48孔板或96孔板內。在凋亡誘導結束后，用可以對多孔板進行離心的離心機1000g離心5分鐘。

b. 吸除細胞培養液，加入PBS洗滌一次。

c. 加入188µl Annexin V-FITC結合液。

d. 加入5µl Annexin V-FITC，輕輕混勻。

e. 加入2µl Mito-Tracker Red CMXRos染色液和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。

f. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。

g. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光，Annexin V-FITC為綠色熒光，Hoechst 33342為藍色熒光。

注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內完成檢測。熒光顯微鏡檢測時，也可以不加入Hoechst 33342染色液。

相關文獻：

[1]Tingting Liu, Cheng Jiang, Liying Zhu, Ling Jiang, He Huang. Fe 3 O 4@chitosan Microspheres Coating as Cytoprotective Exoskeletons for the Enhanced Production of Butyric Acid With Clostridium tyrobutyricum Under Acid Stress Front Bioeng Biotechnol. 2020 May 15;8:449. doi: 10.3389/fbioe.2020.00449.

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