產(chǎn)品名稱：尿液DNA提取試劑盒（離心柱）

產(chǎn)品貨號：TD361-50 (50 次反應(yīng))

產(chǎn)品亮點(diǎn)：

從高達(dá)40毫升的尿液中輕松地純化細(xì)胞DNA/cell-free DNA。

試劑盒配套的尿液穩(wěn)定劑(UCB)可以使DNA在室溫下穩(wěn)定保存長達(dá)1個(gè)月。

純化柱設(shè)計(jì)確保DNA適用于所有敏感的下游應(yīng)用，包括PCR、DNA測序、芯片和DNA甲基化分析等

技術(shù)簡介：

樣品來源-尿液樣本，每次制備最多40ml的尿液。如有需要，樣品體積可按比例增加或減少。

DNA質(zhì)量-高質(zhì)量的DNA可用于下游應(yīng)用，如PCR、亞硫酸鹽處理/甲基化檢測、芯片等。

DNA產(chǎn)量-柱子的DNA結(jié)合容量為5 u8。請注意，DNA產(chǎn)量可能會(huì)因尿液本身而異。女性尿液通常比男性尿液產(chǎn)生更多的DNA。健康女性個(gè)體的尿液DNA平均范圍為6-1000ng/ml。健康男性個(gè)體的DNA平均范圍2-20ng/ml

DNA大小-能夠從100 bp到23 kb恢復(fù)DNA片段。

所需設(shè)備-離心機(jī)、微離心機(jī)和熱塊/水浴。

緩沖液制備：

將48ml100%乙醇(52ml95%乙醇)加入12ml尿液DNA洗滌緩沖液2中，添加好乙醇后在試劑瓶上做好標(biāo)記！

選擇性添加項(xiàng):如遇難處理樣品，可以考慮向基因組DNA裂解液中加入B-巰基乙醇(用戶自備)，最終稀釋為0.5%(v/v)，即每50ml加入250微升

實(shí)驗(yàn)流程：

從≤40ml的樣品中提取 DNA

除非特殊說明，一般在常溫(15-30°C)進(jìn)行以下操作步驟。 以下操作步驟分 3 個(gè)部分:(A)總DNA(細(xì)胞內(nèi)和游離)沉淀

(B)蛋白消化

(C)DNA 純化。

(A)總DNA(細(xì)胞內(nèi)和游離)沉淀

(如果只需要細(xì)胞內(nèi)或者游離的 DNA,操作步驟見附錄)1.將 40ml 的尿液轉(zhuǎn)移到合適的離心管內(nèi)。

注:如果處理≤1毫升的尿液，請使用微離心管。

如果處理>1毫升至14毫升的尿液，請使用15毫升的錐形管。

如果處理>14毫升至40毫升的尿液，請使用50毫升的錐形管。

2.添加 70ul 的尿液穩(wěn)定劑到每 1m!的樣品中，渦旋混勻。(例如 350ul 的尿液穩(wěn)定劑到 5ml的尿液樣品中)

添加了穩(wěn)定劑的尿液可以在室溫下最長保存 1 個(gè)月，需要提取核酸時(shí)，將添加了穩(wěn)定劑的尿液渦旋振蕩，混勻。

如果處理≤14ml的尿液添加 10ul純化珠(使用之前需要渦旋混勻)3.

如果處理 14-40m!的尿液，需要添加 20ul 純化珠(使用之前需要渦旋混勻)。

4.在 3，000xg 下離心 15 分鐘。收集細(xì)胞沉淀。操作方案：

以下離心操作步驟的離心力均在 10,000 - 16,000 x g 之間進(jìn)行。

1. 使用刀片或手術(shù)刀把 DNA 片段從瓊脂糖凝膠上切除下來并且移置到 1.5 ml 小型離心管內(nèi).

Note: 從凝膠上切下的瓊脂糖盡可能的要少.

2. 將 3 倍體積的 溶膠液 添加到每 1 體積從凝膠上切下的瓊脂糖切塊中.

Example:對 于 200 µl (mg) 的 瓊 脂 糖 凝 膠 切 塊 ， 添 加 600 µl 的 ADB 緩沖液.

3. 在 37-55℃ 下溫水浴 10~20 分鐘直到凝膠切塊溶解.

Note: 確定凝膠切塊溶解是很重要的步驟. 在溫水浴過程中可輔以溫和的攪拌有助于凝膠的溶解。 如果 DNA 大小超過 8kb ，加熱之后需要額外添加等量膠塊體積的水。例如： 200 µl (mg) 的瓊脂糖凝膠切塊，添加 600 µl 的 ADB 緩沖液.加熱之后添加 200µl 的水。

4. 將溶解的瓊脂糖切塊溶液放到 2 號柱 中并把柱套在 收集管 里.

5. 離心 1 分鐘. 去除濾出液. Note: 柱所能容納的樣品體積為 800 µl. 所以, 如果樣品體積超過 800 µl 時(shí)，柱就要被多次填充和離心。

6. 添加 200 µl 的 DNA 洗滌液 到柱中離心 1 分鐘，去除濾出液.

7. 重復(fù)第 6 步洗滌步驟.

8. 可選步驟：將收集管中的廢液倒掉，并將 2 號柱套回收集管中額外離心2 分鐘，盡量除去洗滌液，以免洗滌液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

9. 直接添加 25 µl DNA 洗脫液到柱基質(zhì)中. 將柱套在 1.5 ml 離心管中離心 1 分鐘來洗脫

DNA.Note :從柱中洗脫出的 DNA 產(chǎn)量與 pH 和溫度有關(guān). 如果使用水來洗脫， 確保 pH 是>6.0. 在向柱中加入水后靜置 1 分鐘可增加較大 (> 6 kb) DNA 的產(chǎn)量.在 60-70 oC 的水中洗脫 DNA 可增加較大DNA(> 10 kb)的產(chǎn)量

Note: 如果試驗(yàn)需要的話 TE 緩沖液 (10 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA， pH 8.0) 或改進(jìn)的TE (10 mMTris-HCl， 0.1 mM EDTA， pH 8.5) 也可用來洗脫.

在水中得到的超純 DNA 可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

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