一、 試劑盒概述與原理

  產品名稱： E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit

  貨號： D6492

  用途： 用于快速純化PCR、酶切、標記等反應后的DNA產物，去除引物、引物二聚體、dNTPs、鹽離子、酶等雜質。

  原理： 基于 硅膠柱（HiBind® DNA Mini Column） 技術。在高鹽條件下，DNA會特異性地吸附到硅膠膜上，而雜質則被洗脫。隨后在低鹽緩沖液中將純凈的DNA洗脫下來。

  特點：

      快速： 整個過程可在15-20分鐘內完成。

      高效： 對100bp至10kb的DNA片段回收率高。

      高純度： 純化后的DNA可直接用于測序、克隆、酶切、連接等下游實驗。

二、 試劑盒組成（以D6492-01為例，100次預裝）

請在使用前核對以下試劑是否齊全且充足：

1.  CP Buffer： 結合緩沖液（含高濃度離液鹽）。

2.  DNA Wash Buffer（濃縮液）： 漂洗液，使用前必須按說明書要求加入無水乙醇進行稀釋（通常是在整瓶中加入指定體積的無水乙醇）。

3.  Elution Buffer： 洗脫液（10 mM Tris-HCl， pH 8.5）。也可使用無菌去離子水（pH > 7.0）代替，但用Elution Buffer洗脫效率通常更高。

4.  HiBind® DNA Mini Columns： 吸附柱（2 mL）及收集管（2 mL）。

5.  說明書。

三、 標準操作流程

實驗前準備：

  將DNA Wash Buffer按說明書要求用無水乙醇稀釋。

  將CP Buffer和Elution Buffer置于室溫融化。

  準備好無水乙醇。

第一步：平衡結合條件

1.  向您的PCR反應液中加入5倍體積的CP Buffer（例如，50μL PCR產物 + 250μL CP Buffer）。

2.  用移液器充分吹打混勻。

第二步：DNA結合

1.  將混合物全部轉移到HiBind® DNA Mini Column中（柱子裝在2mL收集管內）。

2.  室溫（15-25°C），≥10,000 x g 離心 30-60秒。

3.  棄去收集管中的濾液，將柱子放回同一收集管中。

第三步：漂洗

1.  向柱子中加入 700μL DNA Wash Buffer（已含乙醇！）。

2.  室溫，≥10,000 x g 離心 30-60秒。

3.  棄濾液，將柱子放回收集管。

4.  重復步驟1-3一次（即總共用Wash Buffer漂洗兩次）。

5.  空離以cedi去除殘留乙醇： 將空柱以最大轉速（≥13,000 x g）離心 2分鐘。這一步至關重要，因為殘留的乙醇會嚴重影響下游酶促反應。

第四步：洗脫DNA

1.  將柱子轉移到一個新的、干凈的 1.5mL 離心管中。

2.  向柱子硅膠膜的正中央，懸空滴加 15-30μL Elution Buffer（或無菌水）。

3.  室溫靜置 2-5分鐘，使緩沖液充分浸潤膜。

4.  室溫，≥10,000 x g 離心 1分鐘。離心管底部的液體即為您純化后的DNA。

5.  （可選，用于提高得率） 將離心得到的洗脫液重新加回柱子吸附膜中央，再次離心1分鐘。

四、 關鍵要點與經驗總結

1.  比例是關鍵： “PCR產物：CP Buffer = 1：5" 這個比例必須遵守。這是保證DNA高效結合到柱上的前提。如果產物體積很小，可以先用無菌水補足到一定體積（如50μL）再加CP Buffer。

2.  乙醇是必須的： 使用前務必確認 DNA Wash Buffer 已加入正確量的無水乙醇。未加乙醇的Wash Buffer無法有效去除鹽分。

3.  cedi去除乙醇： 最后的 “空離2分鐘" 步驟絕對不能省略。殘留的乙醇會抑制后續的酶（如連接酶、測序酶等）活性。離心后可以打開柱子蓋，在室溫下再放置幾分鐘讓殘余乙醇wanquan揮發。

4.  提高洗脫效率：

      預熱Elution Buffer： 將洗脫液預熱至65°C或更高溫度，可以顯著提高DNA的洗脫效率，從而提高最終得率。

      洗脫體積： 洗脫體積越小，濃度越高，但總得率可能會略有下降。根據下游應用需求平衡。對于測序，通常用15-20μL洗脫；對于需要高濃度DNA的應用，可以嘗試用10μL洗脫。

5.  關于DNA片段大小： 該試劑盒適用于100bp - 10kb的片段。對于非常小的片段（如<100bp的引物二聚體），在高鹽條件下結合效率較低，因此可以被有效去除。對于非常大的片段（>10kb），結合和洗脫效率會下降，需酌情增加結合和洗脫時間。

五、 下游應用

純化后的DNA適用于：

  Sanger測序

  限制性內切酶消化

  連接與克隆

  體外轉錄/翻譯

  下一代測序（NGS）文庫構建等。

六、常見問題排查

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