為什么要用內參抗體？

更新時間：2025-12-02

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一、內參抗體簡介

內參抗體，就是用來檢測內參蛋白的抗體。它的唯1使命，是作為一個“標尺"或“參照物"，來校正你實驗中的各種誤差。

在Western Blot等實驗中，你的最終目的是比較不同樣本中目標蛋白的表達量差異。但很多操作環(huán)節(jié)都會引入變量，導致比較失真，例如：

細胞裂解程度不同 ? 上樣蛋白總量不同。

上樣操作誤差 ? 每個孔實際加載的蛋白量不同。

轉膜效率不均 ? 轉移到膜上的蛋白量不同。

顯色時間波動 ? 信號強度不穩(wěn)定。

如何解決？引入一個在樣本中恒定表達的蛋白質作為參照，這就是內參蛋白。而檢測它的抗體，就是內參抗體。

二、內參抗體工作原理

1. 前提假設：內參蛋白（如GAPDH、β-Actin）在所有樣本、所有處理組中的表達量是基本恒定的。

2. 同步檢測：在檢測你的目標蛋白（一抗孵育）之后或同時，用內參抗體去檢測同一張膜上的內參蛋白。

3. 數(shù)據(jù)校正：

如果A樣本的目標蛋白信號很強，但它的內參信號也很強，說明可能是A樣本上樣量偏多。

如果B樣本的目標蛋白信號弱，但它的內參信號也弱，說明可能是B樣本上樣量偏少。

最終，你需要用【目標蛋白的信號強度】除以【內參蛋白的信號強度】，得到一個相對表達量。用這個校正后的值在不同樣本間進行比較，才是準確可靠的。

三、常用內參抗體選擇（取決于樣本和研究系統(tǒng)）

內參蛋白	常用抗體克隆/類型	主要適用范圍	注意事項
GAPDH	小鼠單抗（如6C5）	zui常用，適用于大多數(shù)細胞和組織樣本。	在某些代謝研究中或特殊處理下，其表達可能發(fā)生變化。
β-Actin	小鼠單抗（如8H10D10）	細胞質蛋白，適用于細胞和組織，非常常用。	在肌肉細胞或某些癌細胞中表達可能不穩(wěn)定，分子量（~42 kDa）與常見蛋白接近，需注意區(qū)分。
β-Tubulin	小鼠單抗（如9F3）	細胞骨架蛋白，作為細胞質內參。	與β-Actin類似。
Histone H3	兔多抗或單抗	細胞核蛋白內參。專門用于核蛋白提取物或研究核內事件。	不適用于全細胞裂解液。
Lamin B1	兔多抗或單抗	核膜蛋白內參，比H3更穩(wěn)定，是優(yōu)質的核內參。	不適用于全細胞裂解液。
Vinculin	小鼠單抗（如7F9）	細胞骨架蛋白，分子量較大（~124 kDa），可作為高分子量內參。	在某些細胞粘附和遷移研究中可能變化。
COX IV	兔多抗或單抗	線粒體內參。用于線粒體蛋白提取物。	僅用于細胞器級別研究。

四、關鍵注意事項

根據(jù)樣本和研究目的選擇：這是最重要的原則。研究核蛋白就用核內參，研究全細胞蛋白就用GAPDH或β-Actin。

分子量錯開：內參蛋白的分子量應與你的目標蛋白有明顯差異，方便在同一張膜上同時或先后檢測。

驗證表達穩(wěn)定性：在進行正式實驗前，先用內參抗體檢測一下你的實驗樣本（特別是經(jīng)過藥物處理、基因敲除等操作后），確認所選內參的表達確實穩(wěn)定不變。

同源物種反應性：確保你購買的內參抗體能識別你實驗樣本的物種（如人、小鼠、大鼠）。

一句話總結、

內參抗體是實驗的“糾錯官"，通過檢測恒定表達的內參蛋白，來校正上樣量和其他技術誤差，確保你觀察到的目標蛋白差異是真實的生物學變化，而非操作失誤。沒有它，Western Blot的定量比較就失去了根基。

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